近日，9455澳门新葡萄娱乐场大厅成功举办“9455澳门新葡萄娱乐场医药观丨DNA编码分子库（DEL）技术——解码药物发现新思路”网络研讨会，9455澳门新葡萄娱乐场大厅副总裁夏冰博士与著名药物化学家Wes Kazmierski博士前来做客，他们从DEL技术的概念出发，对DEL技术展开交流与对话，特别强调了DEL技术在加速药物研发进程中所发挥的作用，并通过发现同类最佳（BIC） IDO1 抑制剂的案例对DEL技术进行了深入阐述。下面整理了两位嘉宾的部分精彩观点以饕读者。错过本期直播的伙伴，可点击「此处」观看，或者关注“9455澳门新葡萄娱乐场大厅”视频号了解本期完整版视频回放。
夏冰博士：早在1992年，诺贝尔生理学和医学奖获得者Sydney Brenner和Richard Lerner就首次提出了DNA编码化合物库（DNA Encoded Library，DEL）的概念, 但直到2005年二代测序技术出现后，DEL才成为一种经济可行的方法。从那时起，DEL 技术便有了长足的发展，成为药物发现的一个关键组成部分。DEL的工作流程大体可以分为以下几个阶段：DEL库的构建、亲和力筛选、NGS测序、数据分析、不带DNA的化合物再合成，以及苗头化合物的确证。DEL技术具备许多革命性优势：1）采用“Split & Pool”（“混合&均分”）的合成策略可以指数级地扩大DEL库的多样性； 2）基于亲和力的筛选可以最大限度地减少项目前期的研发，也不需要对兴趣靶点有特别深入的了解，而且只需要极少量的靶点蛋白，这使得DEL技术非常适合于First-In-Class（FIC）这类靶点。此外，DEL平台还能缩短项目实验周期和降低运营成本。
但根据业界的经验，为了提高成功率，我们强烈建议将DEL技术与其他技术平台结合使用。我们的 V-DEL 平台与整个9455澳门新葡萄娱乐场一站式药物研发有效融合，形成了极具差异化的竞争优势：
- 9455澳门新葡萄娱乐场大厅以生产包括膜蛋白在内的多种类型的高纯度蛋白质闻名全球。
- V-DEL采用新颖的策略和on- DNA化学反应构建高质量的DEL库；V-DEL使用9455澳门新葡萄娱乐场自有化学平台多年积累的大量新颖合成砌块，这使得我们的V-DEL独一无二。同时在>50名9455澳门新葡萄娱乐场药物化学专家的大力支持下，我们大大缩短了定制DEL库合成、off-DNA分子再合成的时间周期，有效应对了DEL技术目前的这个瓶颈；
- 9455澳门新葡萄娱乐场大厅在使用ASMS和SPR验证DEL产生的苗头化合物这方面极具经验与技术优势；
- 9455澳门新葡萄娱乐场大厅已开发并验证了一系列如（DEL+FBDD/SBDD）、（DEL+FEP）的协同方法，以解决仅靠其中一个平台无法完成的极具挑战性项目；
- 9455澳门新葡萄娱乐场大厅CADD+AIDD平台搭建了强大的计算基础设施和GPU集群，非常有助于提高DEL筛选结果分析及后续研究的成功率。
（图：9455澳门新葡萄娱乐场大厅V-DEL技术平台筛选流程）
Wes Kazmierski博士：首先，我介绍一下分别发表在JMC和ChemBioChem期刊上的两篇论文：《DNA-Encoded Library Technology-Based Discovery, Lead Optimization, and Prodrug Strategy toward Structurally Unique Indoleamine 2,3-Dioxygenase-1 (IDO1) Inhibitors》和《Characterization of apo-form selective inhibition of indoleamine2,3-dioxygenase》，这两篇是由我和同事撰写的，夏博也为第一篇文章作出了重大贡献。这些论文提供了在本次网络研讨会中未涵盖的额外细节，有兴趣的听众可以进一步查阅。IDO1是一种含血红素的酶，催化色氨酸氧化为N-甲酰基酮尿氨酸，这是酮尿氨酸代谢途径中的第一步及限速步。IDO1与其密切相关的IDO2和TDO共同代谢哺乳动物90%以上的总色氨酸。IDO1在抗病原体感染或细胞炎症时被诱导或上调，这限制了T细胞功能，并导致免疫抑制和局部免疫耐受。IDO1也会帮助癌细胞逃避免疫系统的检测，因此对IDO1的抑制也被认为可以产生抗癌作用。色氨酸的耗竭以及其代谢产物犬尿氨酸的过度生成（此现象可总体表示为高的K/T比）也与中枢神经系统疾病（如阿尔茨海默病）及HIV患者在抗逆转录病毒疗法中增加的发病率和死亡率相关。因此IDO1一直是药物研发中一个热门的靶点，也产生了许多处于临床阶段的IDO1抑制剂。但它们在活性和药代动力学特性上存在不足，需要高剂量和多次服用，对支持患者的用药依从性也不理想。因此我们希望通过高通量筛选（HTS）和DEL筛选发现新化学型的苗头化合物来解决这些问题。
（左图来源于：J. Med. Chem. 2020, 63, 7, 3552–3562, Publication Date:February 19, 2020,
https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.9b01799；右图来源于：Chembiochem. 2021 Feb 2;22(3):516-522. doi: 10.1002/cbic.202000298. Epub 2020 Nov 16. PMID: 32974990.）
夏冰博士：在FIC药物开发中，找到一个“起点”甚至是一个探针化合物都是非常理想的，而在BIC药物的演化过程中我们通常需要找到具备新颖化学型苗头化合物。DEL筛选在这两种情境下都能发挥很重要的作用（在这里强调一下，大家不要忽视DEL技术在BIC药物的演化过程中的重要作用）。在具体应用 DEL 筛选发现 IDO1 抑制剂的过程中，首先我们使用了一个II期临床试验化合物作为竞争抑制剂，并在筛选缓冲液中加入抗坏血酸和亚甲蓝，以确保其维持一个恰当的氧化还原体系。值得注意的是，筛选温度被设定在一个非常规的37°C。初步筛选数据表明 IDO1 是一个非常适合 DEL 技术的靶标，这很令人兴奋。在处理数据时，我们更倾向于选择信号强度大于4.01，而且在已知活性位点抑制剂存在时信号强度下降，并在单个库内和全部库间显示出明确SAR证据，分子量低于450，cLogP小于4的化学型进行off-DNA再合成。我们高兴地发现，符合这些标准的九种化学型中，七种在细胞实验中得到了确认。其中我们优先考虑DEL76*系列是基于对该靶点的深刻理解：这种化学类型的富集值虽然不是最高，但它与IDO1的天然底物--色氨酸，都含有吲哚核心。然而，尽管这些化学型在细胞实验中得到了确认，但我们在生化实验中却观察到令人困扰的不一致。经过进一步检查，我们意识到DEL筛选和基于细胞的实验都是在37°C进行的，而HTS酶活性测定则是在室温（25°C）下操作。小小12度的温差竟造成了如此大的差异，是什么原因呢？
*夏冰博士分享完用Larock杂环化合成DEL 76 DEL 库的细节后，进一步开展介绍了一下当前业界构建DEL库的两大流派（如以下幻灯片所示），a) 在DNA上直接合成杂环，和b) 先合成杂环再对其进行修饰，及它们各自的优缺点，比如前者形成的分子刚性更好，而后者构建的库多样性更高，随后提出了V-DEL建库的新思路和新方案，并承诺将在之后的系列讲座中详细阐述，敬请关注。
Wes Kazmierski博士：为了解开这个谜团，我们对IDO1的作用机理进行了探索，并借用了先前一个与此处描述的项目无关的内部先导化合物GSK5628作为工具化合物。这项研究于2020年在《Chembiochem》上发表，标题为《Characterization of Apo-Form Selective Inhibition of Indoleamine 2,3-Dioxygenase》。数据表明，与结合全-IDO1（含血红素）的传统IDO1抑制剂（如epacadostat）不同，GSK5628竞争性地结合无血红素的IDO1。而这第二种机理需要更长的孵育时间或更高的孵育温度，从而导致之前在略有不同温度下进行的实验中观察到的差异。DEL76分子被证明类似于GSK5628也是通过结合无血红素的IDO1来抑制IDO1的。在验证了DEL hit 1的作用模式后，我们便启动了优化结构-活性关系（SAR）的工作。“非结晶11”在大鼠体内表现出很高的生物利用度，但当使用“晶体11”时，其在大鼠和狗体内的生物利用度都显著降低。测定完晶体11的FaSSIF溶解度后，我们推论出这种化合物的低生物利用度是由于其低溶解度和溶解度限制的吸收所导致。能解决这个问题的一个策略是探索使用11的前药。我们在制备并在体内评估了多种前药后，磷酸氧甲基化前药31及其三盐结晶32显示出口服高吸收度，它可以在血浆中迅速转化为11。药代动力学特性和人体药代动力学模拟表明，前药32的60毫克BID剂量可以在24小时内将足够的11输送到全身，并在任何给定时间点抑制超过90%的IDO1。我们在解决了DEL hits在标准酶活性测定中未被验证的问题之后，成功地利用了DEL 技术产生的苗头化合物，并通过作用机理，基于药物化学的SAR，及前药设计，最终找到了IDO1同类最佳（BIC）的临床前候选化合物。其中DEL技术的采用极大缩短了药物发现的时间，因为DEL技术产生的苗头化合物hit 1在筛选过程中就已经得到了预优化，所以在后期优化中只需要合成约200个类似化合物，仅是典型药物化学项目在这个阶段所需合成化合物数目（~2000）的很小一部分。与此同时，把DEL技术产生的苗头化合物 hit 1优化成临床前候选化合物PCC 32，也需要精确理解MOA和有强大的药物化学设计能力，这再次强调了协同作战的必要性。
夏冰博士：在研讨会结束之前，我想再介绍一个DEL和其他hit ID方法协同作战的案例。众所周知，在药物研发过程中，我们总是尽量同时开发备选系列。由于成功地开发了DEL76螺环系列，我们决定在DEL76“立方体视图”中再次分析筛选数据，视图中有一条和代表DEL hit 1的直线相邻的直线引起了我们的注意，当把这两条SAR线所代表的化学结构对齐后，我们惊喜地发现了一种很不寻常的打开DEL76螺环系列的方式。进一步结合计算化学设计的另一个骨架对这个新获得的螺环开环结构进行骨架跃迁后，我们又获得了一个 IDO1 临床前候选化合物！
至此，DEL在IDO1项目中发挥的关键作用可以总结如下:
- 发现并验证了多种不同化学结构的先导化合物系列（命中率高达80%）
- 观察到了基于细胞检测和生化检测之间的不一致，并由此“挽救”了HTS筛选会遗漏的好结果
- 获得了通过与血红素竞争apo-IDO1新机理的苗头化合物
- 良好展示了HTS和DEL之间的协同作用：a) 帮助团队更好地理解了靶点IDO1，尤其是温度对酶活性机理的影响；b) 产生了螺环开环化合物系列，然后对其进行了DEL/HTS/计算设计骨架跃迁
- DEL技术产生的苗头化合物的DNA链接位置非常有助于设计用于pull-down实验的探针
- 协助了前药及其结晶盐的发现并有力地推进了化合物至临床前候选阶段
想分享给大家的一个关键点是：不要简单地把DEL技术产生的苗头化合物与其他技术产生的苗头化合物用同样的方法处理，务必把它放回到其筛选和DEL库的相关背景信息中，您会惊讶地发现这能为你提供更多有价值的信息。
最后，9455澳门新葡萄娱乐场大厅提供的解决方案是，基于第一性原则：Affinity first, specificity and potency pave the path, good molecules will come naturally.
特别致谢
夏冰博士和Wes Kazmierski博士：由于时间限制，只能把合作者的名字放在致谢幻灯片上，而不能读每个人的名字，但我们非常感谢GSK的前同事，这是一次很棒的团队合作！
如需了解更多信息，欢迎通过info@vivabiotech.com邮件与我们专家团队沟通。
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